Principais testes de diagnóstico da hemostase

Tempo de Protrombina (PT)

O factor II, também chamado de Protrombina, é uma glicoproteína sintetizada no fígado. A síntese completa da molécula requer a presença de vitamina K. A sua principal função é a conversão do fibrinogénio em fibrina.

O teste do tempo de protrombina explora a via extrínseca e o tronco comum da coagulação. É medido o tempo de coagulação a 37ºC de um plasma recalcificado posto na presença de factor tissular e tromboplastina que activa o factor X. A medição é feita automaticamente.

Para isso é usado o reagente IL Test TP-Fibrinogénio Recombinante. Trata-se de tromboplastina de alta sensibilidade baseada em factor tissular recombinante de coelho, para avaliar a via extrínseca da coagulação e também para o controle da terapia de anticoagulante oral em plasma humano citratado.

Ao ser adicionado este reagente ao plasma do paciente, inicia-se a activação da via extrínseca da coagulação. Isto resulta finalmente na conversão do fibrinogénio em fibrina, através da formação de um gel sólido. O fibrinogénio é quantificado, relacionando a dispersão de luz produzida durante a formação do coágulo com um calibrador.

Os resultados são mais frequentemente expressos em percentagem por referência a um padrão. A taxa de protrombina (PT) é normalmente superior a 70%, sendo a relação paciente/padrão<1,3. Pode também ser dado o resultado em segundos (valor de referência: 11-45 s).

O tempo de protrombina pode estar falsamente elevado se o doente se encontrar sob o efeito da heparina que possui uma acção antitrombótica) e se o fibrinogénio estiver muito baixo.

O PT é muito utilizado para avaliar a eficácia de um tratamento com anticoagulantes orais, normalmente do tipo cumarínico (varfarina), por deficiência de vitamina K porque é sensível à diminuição de três dos factores dependentes da vitamina K. (Fig 98).

A varfarina bloqueia a carboxilação do glutamato dos percursores dos factores de coagulação, dependente da vitamina K ( Fig 97)

É aconselhável associar à medição do PT um outro teste de coagulação, o aPTT é usado.

Existem variados interferentes como sejam medicamentos, anticoagulantes, hemólise, lipémia, amostras ligeiramente coaguladas.

Devido à falta de padronização da tromboplastina, o PT não é reprodutível de um laboratório para outro, o que torna muito difícil o ajustamento do tratamento quando os doentes mudam de laboratório. Para suprimir este inconveniente, tem sido proposto exprimir os resultados sob a forma de um index INR (International Normalised Ratio).

Este valor (INR) é a razão entre o tempo de protrombina do paciente, expresso em segundos e o tempo padrão. Esta razão é depois elevada a uma potência ISI ou índice de sensibilidade internacional, que caracteriza a tromboplastina utilizada relativamente a um valor padrão. Este índice de sensibilidade internacional pode constituir como um valor de calibração que é obtido com a comparação do reagente a usar com uma preparação de referência Internacional.

O INR constitui assim uma expressão internacional do valor do PT, independente do laboratório onde o teste é efectuado. O valor de INR será 1 quando o tempo do doente for igual ao tempo padrão. Se o doente possuir problemas no processo de coagulação, o tempo de protrombina tende a aumentar. Quanto mais este tempo aumentar mais o INR ultrapassará o valor de 1. Um INR de cerca de 5 está associado a um alto risco de hemorragia. Neste sistema a zona terapêutica situa-se entre 2 a 4, para pessoas com tratamentos com anticoagulantes orais.

Grande parte dos factores dependentes da vitamina K são doseados pelo PT. A hipovitaminose K conduz, portanto, a um aumento do tempo de protrombina. Uma hipovitaminose K ocorre por icterícias obstrutivas e perturbações da absorção.

Uma insuficiência hepática moderada apresenta primeiro um quadro próximo do das hipovitaminoses K, porque os factores dependentes da vitamina K são sintetizados pelo fígado. Mas, desde que a insuficiência hepática exista, ocorre um prolongamento do PT com diminuição de vários factores, frequentemente associado a uma descida do fibrinogénio. Em caso de cirrose, há muitas vezes trombocitopenia e desfibrinogenemia, que contribui para o prolongamento do tempo de protrombina.

No tratamento com anticoagulantes devem ser efectuados testes periódicos para controlo da terapêutica administrada.

A síndrome de coagulação intravascular disseminada é devida a uma activação patológica da hemostase (com formação de trombos fibrinoplaquetários disseminados) que ultrapassa os mecanismos inibidores fisiológicos, traduzindo-se por hemorragias e necroses tecidulares. No decorrer desta doença são consumidas plaquetas e factores de coagulação, que leva a um prolongamento do PT. O prolongamento do PT testemunha, por sua vez, a hipofibrinogenemia e a acção inibidora dos PDF.

 

Tempo de Tromboplastina Parcial activada (aPTT)

            Este é o teste mais utilizado para a exploração dos factores plasmáticos da via intrínseca da coagulação. Com efeito, permite o estudo de todos os factores da via intrínseca e o tronco comum da coagulação, com excepção dos factores plaquetários.

É medido o tempo de coagulação a 37ºC do plasma desprovido de plaquetas, citratado e colocado em contacto com fosfolípidos (cefalina), substituto do fornecimento plaquetário, de cálcio e de um activador dos factores de contacto. Este activador foi durante muito tempo o caulino; actualmente, recorre-se mais a outro activador (sílica). Este activador estimula a produção de factor XIIa e proporciona uma superfície de contacto ideal que permite uma activação funcional do quininogénio de alto peso molecular e calicreína.

O cloreto de cálcio que se adiciona faz desencadear as reacções posteriores, que produzirão a formação do coágulo. Os fosfolípidos são necessários à formação de complexos que activarão o factor X e a protrombina.

O reagente usado para este teste é o Hemosil aPTT-SP (líquido) e contém fosfolípidos sintéticos e sílica que assegura uma reprodução e uma grande estabilidade do produto.

A medição efectua-se com o auxílio de aparelhos automáticos. Os resultados são expressos em segundos e/ou razão em relação ao padrão.

O activador encurta o tempo de coagulação de modo que o aPTT está habitualmente compreendido entre 35 a 45 s. O tempo do doente é comparado com um plasma testemunha. O desvio não deve ultrapassar 6 a 8 segundos e a relação tempo do doente / tempo do plasma “pool” deve ser <1,2.

A medida do aPTT é muito utilizada para regular e vigiar os tratamentos anticoagulantes pela heparina. A zona terapêutica nestes casos é considerada como sendo o valor aPTT 1,5 a 2,5 vezes superior ao valor normal médio.

Este anticoagulante exerce a sua função por interacção com a antitrombina III, que inibe os factores de coagulação, formando complexos estáveis com eles. A antitrombina III ao ser ligada à heparina é activada devido a alterações conformacionais. Este efeito acelera a sua capacidade de inactivar enzimas de coagulação. Depois a heparina dissocia-se do complexo e fica livre para interactuar com mais antitrombina III.

Um prolongamento espontâneo do aPTT de mais de 10 segundos em relação ao padrão, com tempo de protrombina normal, traduz, quer um défice num dos factores da via intrínseca quer a existência de um anticoagulante circulante.

Os défices da via intrínseca mais frequentes são a hemofilia A e B, doença que se traduz por hematomas e hemartroses das articulações. Na doença de Willebrand (diminuição ou falta do factor de Willebrand) existe um aumento do aPTT proporcional ao défice em factor VIII. Muito mais raramente o aumento de aPTT sugere um défice noutros factores de coagulação.

 

Tempo de Trombina (TT)

Este teste serve para o estudo da última fase da coagulação, a transformação do fibrinogénio em monómeros de fibrina.

            Para isso mede-se o tempo de coagulação a 37ºC de um plasma recalcificado na presença de trombina que activa a transformação do fibrinogénio em fibrina. Para tornar mensurável esta curta fase é necessário proceder a uma diluição da trombina.

            Como a trombina é inibida pela heparina, é usado para o teste uma substância derivada de veneno de cobra, reptilase, que tem uma acção similar à trombina mas não sofre a inibição pela heparina.

            Normalmente este valor deve ser inferior a 22 segundos, (normalmente é considerado o intervalo 15 a 20s), mas sofre a interferência de sangue que esteja coagulado ou hemolisado.

O tempo de trombina deve ser realizado antes de outro estudo específico, quando há um prolongamento do PT e do PTT que não possua explicação evidente. O tempo de trombina permanece normal nas deficiências de factor XIII.

            O tempo de trombina está aumentado quando se produz uma hipofibrinogenemia ou quando existe no plasma uma antitrombina. Pode estar aumentado na presença de heparina, PDF, etc.

            A descida do fibrinogénio pode provocar o prolongamento do tempo de trombina e verifica-se nos defeitos de síntese hepática (cirroses, hepatites) ou de fibrinólises. Também ocorre quando o fibrinogénio é de má qualidade. (desfibrinogenemia).

            A antitrombina mais conhecida é a heparina. O tempo de trombina é muito sensível à presença de heparina. Havendo suspeita da presença de heparina (no doente ou no tubo) é necessário fazer o exame com a reptilase que activa igualmente a transformação do fibrinogénio em fibrina, mas que é insensível à acção da heparina.

Se o tempo de trombina não for corrigido pela reptilase significa que existe no plasma uma actividade antitrombina (imunoglobulina monoclonal, PDF).

Entendendo a coagulação

Hemostase

         Podemos definir hemostase como um conjunto de mecanismos normais de defesa do organismo desenhados para prevenir a ocorrência de hemorragias espontâneas ou evitar as hemorragias excessivas nos vasos sanguíneos lesados. O sangue é mantido no estado de fluidez necessário. Envolve a adesão plaquetar e a agregação para a formação de trombos que são reforçados por fibrina para aumentar a sua estabilidade.

            A hemostase normal pode ser dividida em hemostase primária e secundária, sendo geralmente iniciada por trauma, cirurgia ou patologias que causem lesão do endotélio vascular.

            A hemostase primária é o processo de união plaquetária no sítio da lesão, em resultado da vasoconstrição que conduz a uma diminuição do fluxo de sangue no local lesado. Representa a primeira acção no sentido de deter as perdas sanguíneas pelos capilares, vénulas e arteríolas. Tem acção em segundos após a lesão.

            As plaquetas levam à activação de mais plaquetas e ocorre um conjunto de alterações funcionais e morfológicas que fomenta o processo de agregação. Ocorre a libertação de factores de agregação (tromboxano A2 e ADP) que promovem uma maior agregação.

 

 

Fig  activação de plaquetas

 

            Este processo leva à formação de um tampão plaquetário limitado pela acção anti-agregante de inibidores naturais, como a prostaciclina libertada pela parede vascular.

            A hemostase secundária consiste na reacção do sistema de coagulação sanguínea que resulta na formação de fibrina. Requer alguns minutos até estar completa. É designada por mecanismo de coagulação.

            A hemostasia primária e secundária estão interligadas entre si, pois as plaquetas activadas, aceleram a coagulação sanguínea e produtos de reacção da coagulação do plasma, induzem a activação plaquetária.

            Logo que a agregação plaquetária se inicia, proteínas da coagulação plasmáticas são activadas e inicia-se a hemostase secundária, quer seja pela via intrínseca, quer seja pela via extrínseca, levará ao último estado de coagulação que é a formação do coágulo de fibrina. Este forma-se a partir da conversão da protrombina em trombina, que por sua vez actua na conversão do fibrinogénio em fibrina.

            A formação deste coágulo envolve a interacção sequencial de uma série de proteases serínicas e substratos numa acção altamente ordenada e complexa, bem como a interacção destes complexos com as plaquetas e com compostos libertados pelos tecidos. Estes factores formam a chamada cascata de coagulação.

            Neste processo estão envolvidos 2 sistemas: o sistema intrínseco, com todos os factores presentes no sangue; sistema extrínseco que necessita de um factor externo que é libertado pelo tecido e pelas células lesadas, a tromboplastina tecidular.

            Os 2 sistemas possuem tempos de início distintos. O sistema extrínseco tem uma duração de 10 a 20 segundos enquanto o sistema intrínseco tem a duração de 2 a 3 minutos.

 

 

Fig  Esquema da cascata de coagulação

Assim que a hemostase está completa, inicia-se o processo de lise do coágulo e reparação das veias, por remoção dos restos de fibrina ou coágulos que se possam ter depositado no sistema vascular, com a transformação do plasminogénio em plasmina, importante para degradar o coágulo de fibrina. Este processo tem o nome de fibrinólise.

            A coagulação e formação do trombo estão normalmente confinadas a zonas localizadas de hemorragias devido ao processo de fibrinólise, já referido, e à inibição da fibrina por acção dos inibidores dos factores de coagulação. O desenvolvimento de doença trombótica ou hemorrágica é o resultado final de um desequilíbrio dos factores anti e protrombogénicos.

As amostras devem ser processadas nas 4 horas após a colheita. Esta deve ser realizada com a mínima estase. Deve ser evitada a hemólise pois os eritrócitos têm membranas com fosfolípidos com actividade de tromboplastina, o que provoca alterações dos tempos de coagulação. A amostra de sangue total é colhida para um tubo com citrato de sódio como anticoagulante. As amostras devem ser centrifugadas, o mais rapidamente possível, a 3000 rpm durante 10 minutos. Para os testes da coagulação é utilizado o plasma. Os testes são realizados em tubos primários.

As diferentes fases da hemostase podem ser exploradas em certos testes realizados. A hemostase primária pode ser avaliada também por contagem das plaquetas. A via intrínseca na coagulação é avaliada através do tempo de tromboplastina parcial activada. A via extrínseca é essencialmente avaliada pelo tempo de protrombina. A fase final é avaliada pelo tempo de trombina e doseamento do fibrinogénio plasmático. A avaliação da fibrinólise pode ser feita pelo doseamento dos produtos de degradação da fibrina.